Иммунология - Ковальчук Л.В. - Практикум
Год выпуска: 2010
Автор: Ковальчук Л.В.
Жанр: Иммунология
Формат: PDF
Качество: OCR
Описание: Иммунологии вскоре предстоит занять весьма важное место в структуре фундаментального медико-биологического образования. Мы не знаем ни одного даже самого узкого медицинского специалиста, способного обойтись без иммунологии: она нужна либо для понимания патогенеза болезней, либо для проведения иммуноанали-зов, а чаще и для того, и для другого. Но хотя в практике клинических и биологических исследований иммунологические методы лидируют, в программе шестилетнего высшего врачебного образования почти не предусмотрено их профессиональное изучение. Не зная технологий современных иммуноанализов, врач не в состоянии самостоятельно понять, что факт наличия той или иной инфекции в крови пациента (положим, ВИЧ) можно надежно установить с вероятностью 100% (пусть для этого надо будет выполнить не одно, а несколько разных исследований), а вот факт отсутствия инфекции нельзя надежно установить никакими методами.
Цель данного учебного пособия — познакомить студентов и врачей на профессиональном уровне с современными методами исследования, используемыми в экспериментальной и клинической иммунологии с аллергологией. Приведены основные характеристики и этапы использования разнообразных иммунологических методов, часть которых легко воспроизвести в рамках практических занятий на кафедре иммунологии и на смежных кафедрах медицинских и биологических вузов.
Иммунологические методы, применяемые как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях, делятся по крайней мере на 8 групп.
I. Методы определения или детекции тех или иных веществ, характеризующихся наличием уже полученных специфичных антител против них. Эти методы принято называть в международной специальной литературе методами иммуноанализа. В соответствии с применяемыми технологиями визуализации взаимодействия антитела и антигена иммуноанализ подразделяется на:
- методы агглютинации корпускулярных антигенов (непосредственная агглютинация антигена, гемагглютинация, латексагглютинация, нефелометрия);
- методы с использованием технологии гемолиза (тесты фиксации комплемента, торможения фиксации комплемента, метод подсчета антителообразующих клеток по Йерне);
- методы преципитации комплексов «антиген—антитело» в гелях (методы Оухтерлони, Элека, Манчини и др.);
- иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, имму-нофлюоресцентный анализ — наиболее высокочувствительные и наиболее употребимые в настоящее время виды иммуноанализа.
II. Методы фракционирования — физическое разделение растворимых молекул или клеток иммунной системы:
- выделение иммуноглобулинов высаливанием солями серной кислоты;
- методы хроматографии (высокоэффективная; аффинная и др.);
- центрифугирование в средах с градиентами плавучей плотности (выделение мононуклеарных клеток центрифугированием на фиколл-гепаке; выделение нейтрофилов седиментацией на растворе желатина, декстрана и др.);
- электрофорез;
- проточная цитофлюорометрия, в том числе с использованием тетрамерных комплексов.
III. Иммуногистохимические методы (иммунофлюоресцентная микроскопия; микроскопия препаратов тканей или клеток с фиксированными антителами, меченными ферментной меткой).
IV. Методы молекулярной биологии (полимеразная цепная реакция; иммуноблоттинг: Western-блот определяет белок, Southern-блот определяет ДНК, Northern-блот определяет РНК).
V. Генетические методы:
- методы направленного мутагенеза — «нокаут» и «нокин»;
- методы изучения экспрессии генов и методы картирования и исследования конкретных мутаций (технологии микроэрреев).
VI. Методы биотехнологии — клонирования молекул, ПЦР, методы получения рекомбинантных белков, клеток (гибридомные технологии), создание линий инбредных животных, биотехнологические методы получения и оценки вакцин.
VII. Методы изучения свойств нативных клеток иммунной системы в культурах in vitro (методы биологического тестирования цитокинов; методы оценки пролиферации клеток; методы исследования факторов транскрипции и др.).
VIII. Методы исследования функций и взаимодействия клеток in vivo (радиационные химеры; сканирование меченых клеток in vivo и др.).
Проводится наиболее детальное описание некоторых тестов, подходящих для практических занятий со студентами (обозначения: «Лабораторная работа 1-1» и т. д.).
Особое внимание в книге уделяется проблеме цитокинов. В соответствующем разделе не только представлены конкретные методы их идентификации, но и сформулирован подход к оценке системы цитокинов в целом, что очень способствует формированию суждения о комплексности этой важнейшей для организма системы межклеточных медиаторов. Особо подчеркнем: сейчас в клинической медицине отмечается рост числа патологических процессов, обусловленных избыточной или недостаточной продукцией цитокинов.
Учебное пособие по иммунологии предназначено студентам врачебных и биологических специальностей медицинских вузов и университетов, а также ординаторам, аспирантам, врачам всех специальностей, специалистам, работающим в разных областях биологии и медицины.
Содержание практикума
«Иммунология»
Объекты исследования в иммунологии
- Инбредные животные
- Линии мышей с генетическими дефектами, затрагивающими иммунную систему
- Линии мышей с аутоиммунной патологией
- Биологические материалы для исследований
- Методические особенности работы с иммунокомпетентными клетками
Методы разделения клеток периферической крови
- Выделение лейкоцитов
- Выделение мононуклеарных клеток
- Выделение моноцитов
- Выделение нейтрофилов
- Аналитическая и препаративная цитофлуориметрия
- Иммуномагнитная сепарация клеток
Методы изучения функциональной активности клеток иммунной системы in vitro и in vivo
- Оценка пролиферативной активности лимфоцитов
- Оценка клеточной цитотоксичности
- Оценка функциональной активности фагоцитов
- Культура клеток in vivo
Иммуноанализы
- Методы определения преципитатов антител с антигенами в геле
- Иммуноферментный и радиоиммунный анализы
- Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность тест-систем иммуноанализов
- Определение количества клеток, секретирующих тот или иной продукт, — метод ELISPOT
- Методы исследования внутриклеточных цитоплазматических и ядерных белков — факторов транскрипции, сигнальных молекул и других
Гибридомная технология. Моноклональные антитела
Генетические методы исследования в иммунологии
- Полимеразная цепная реакция
- Исследование экспрессии генов методом микрочипов
- Получение мышей с нокаутом (knock-out) и нокином (knockin) генов — метод направленного мутагенеза
- Применение регуляторных микро-РНК в иммунологических исследованиях
Методы оценки системы цитокинов
Литература