ПЦР «в реальном времени» - Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю.

Год выпуска: 2009

Автор: Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др.

Жанр: Диагностика

Формат: PDF

Качество: OCR

Описание: В книге рассмотрены различные варианты и особенности оборудования для проведения ПЦР «в реальном времени». Разобраны особенности систем флуоресцентной регистрации накопления ДНК. Рассмотрены ключевые факторы, определяющие выбор последовательности олигонуклеотидов и параметры программ амплификации. Уделено внимание подготовке проб и особенностям анализа получаемых данных.

Отдельные главы посвящены применению ПЦР «в реальном времени» для решения различных задач: определения уровня представленности транскриптов, вирусной нагрузки, нуклеотидного полиморфизма, относительного содержания нуклеиновых кислот на примере ГМО.
Для сотрудников генно-инженерных и медицинских диагностических лабораторий, а также для преподавателей и студентов, специализирующихся в области молекулярной биологии.

Развитие большинства современных научных дисциплин напрямую связано с развитием применяемых исследователями методов. В последние десятилетия именно новые методические подходы определяли прорывы в области биохимии и молекулярной генетики. При этом понимание сути используемых методик всегда являлось необходимым условием эффективного экспериментального подхода. Одним из таких методов, позволивших генетикам и молекулярным биологам сделать сразу несколько огромных шагов вперед, безусловно стало изобретение метода полимеразной цепной реакции.

Несмотря на то, что принцип ПЦР понятен большинству школьников после краткого его изложения, этот метод обладает массой нюансов, о существовании которых подозревают далеко не все исследователи, использующие его в повседневной практике. Так, далеко не каждый экспериментатор учитывает влияние эффективности ПЦР на результат амплификации. А между тем данный параметр определяет возможность сравнения результатов для разных реакций. Другой пример типичного «заблуждения» — отождествление накопления ДНК и накопления флуоресцентного сигнала при проведении ПЦР «в реальном времени», хотя есть масса примеров из практики, когда эти процессы идут независимо.

Предлагаемая читателю книга направлена, в первую очередь, на объяснение тонкостей метода полимеразной цепной реакции с регистрацией результатов в режиме «реального времени». Авторы постарались рассмотреть все нюансы метода, позволяя читателю разобраться в сути процесса. Работа выстроена по принципу использования метода ПЦР « в реальном времени» для решения различных задач. При этом авторы постарались сделать так, чтобы исследователь мог обратиться к каждой отдельной главе, поняв особенности данного варианта применения метода даже без прочтения всей книги.

Л. А. Остерман

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) «в реальном времени» — методика, прочно вошедшая в повседневную практику исследовательских и клинических лабораторий по всему миру. Спектр задач, для решения которых применяется ПЦР «в реальном времени», увеличивается с каждым днем. Сюда можно отнести как сферу научных исследований (определение уровня экспрессии генов, анализ количественного соотношения альтернативно сплайсированных форм мРНК и т. д.), так и сферу прикладных применений (определение уровня бактериальной или вирусной нагрузки органа, поиск следом генно-инженерных конструкций в продуктах питания и т. д.).
Несмотря на то, что число обзоров и Монографий (A-Z of Quantitative PCR; Real-Time PCR (BIOS Advanced Methods)), посвященных ПЦР «в реальном времени», постоянно растет, ощущается значительная нехватка подобных работ на русском языке. Поэтому книга Д. В. Ребрикова с соавторами, являющаяся первой работой такого уровня, посвященной различным аспектам ПЦР «в реальном времени», вне всякого сомнения, актуальна и с успехом заполнит существующий вакуум соответствующих русскоязычных учебных пособий.
Книга написана коллективом авторов, не просто использующих ПЦР «в реальном времени» в повседневной практике, но являющихся ведущими в нашей стране разработчиками оборудования и реагентов для ПЦР в «реальном времени». Разностороннее и творческое понимание физической и биологической составляющих научной основы метода помогло авторам в полной мере осветить особенности ПЦР «в реальном времени» и дать читателям точную, написанную доступным языком картину процессов, идущих в реакционной пробирке.
По своей структуре и глубине описания этих процессов книга нацелена, в первую очередь, на сотрудников научно-исследовательских лабораторий и студентов, стремящихся разобраться в фундаментальных принципах и нюансах метода. Вместе с тем, каждая глава содержит много конкретных практических рекомендаций, делая книгу ценной также для практикующих специалистов.

Е. Д. Свердлов

Академик РАН и РАСКН, советник РАН

Содержание книги

«ПЦР в реальном времени»

Что такое ПЦР

• Изобретение ПЦР
• Изобретение ПЦР «в реальном времени»
• Отличие анализа продуктов ПЦР «по конечной точке» и «в реальном времени»
• Развитие ПЦР «в реальном времени» как диагностического инструмента

Основы полимеразной цепной реакции

• Общие сведения о ПЦР
• Организация ПЦР-лаборатории
• Оборудование и материалы для ПЦР
• Свойства олигонуклеотидов (праймеров и проб)
• Влияние ионов Mg²⁺
• Свободные дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTPs)
• Влияние pH
• Минеральное масло
• Другие компоненты, добавление которых влияет на ПЦР
• Ферменты, используемые в ПЦР
• Программы амплификации
• «Горячий старт» (hot start)

Оборудование для ПЦР «в реальном времени»

• Устройство детектирующих амплификаторов
• Основные функциональные узлы
• Обзор характерных разновидностей приборов
• Тенденции развития оборудования для ПЦР «в реальном времени»

Визуализация накопления ДНК при проведении ПЦР «в реальном времени»

• Флуоресценция
• Флуорофоры
• Гасители флуоресценции
• Неспецифичные системы детекции
• Специфичные системы детекции

Дизайн праймеров и проб, программы амплификации

• Параметры, влияющие на взаимодействие олигонуклеотида и ДНК
• Выбор последовательности проб
• Программное обеспечение для дизайна праймеров и проб
• Особенности систем праймеры-проба
• Особенности программ амплификации для ПЦР «в реальном времени»

Особенности очистки нуклеиновых кислот для ПЦР «в реальном времени»

• Общие принципы очистки нуклеиновых кислот для использования в ПЦР
• Особенности взятия биоматериала для клинических ПЦР-исследований и риск контаминации
• Особенности методов очистки НК для ПЦР «в реальном времени»
• Типовые ошибки использования ПЦР «в реальном времени», связанные с количеством нуклеиновых кислот, забираемых в реакцию

Анализ данных ПЦР «в реальном времени»

• Методы и средства анализа графиков накопления ДНК
• Простая модель ПЦР
• Связь флуоресцентного сигнала и накопления ДНК в ходе ПЦР
• Пороговый метод сравнения графиков накопления
• Определение эффективности ПЦР ДНК (C_t)
• Недостатки порогового метода и пути их преодоления
• Методы прямого сравнения графиков накопления ДНК (С_р)
• Комбинация методов C_t и С_р

Определение уровня представленности транскриптов

• Организация эксперимента
• Абсолютное определение уровня представленности транскриптов
• Относительное определение уровня представленности транскриптов
• Нормировка данных
• Внутренний контрольный образец
• Отрицательный контрольный образец

Количественное определение вирусной нагрузки

• Количественное определение вирусной нагрузки
• Источники погрешностей и варианты учета потерь и эффективности реакции

Использование ПЦР «в реальном времени» для определения однонуклеотидного полиморфизма

• Однонуклеотидный полиморфизм последовательностей ДНК
• Идентификация ОНП с помощью аллель-специфичных праймеров
• Дифференциация аллелей с помощью олигонуклеотидных проб
• Генотипирование ОНП методом плавления ДНК-дуплексов

Определение относительного содержания нуклеиновых кислот на примере генетически модифицированных источников

• Общие сведения о ГМИ
• Классификация существующих методов определения ГМИ в продуктах питания
• Организация чужеродной ДНК в геноме растений
• Выбор последовательностей-мишеней для выявления чужеродной ДНК в геноме растения
• Тест-системы для определения процентного содержания чужеродной ДНК относительно геномной ДНК растений
• Выбор чужеродной и нормировочной ДНК для количественного определения ГМИ
• Калибровочные образцы
• Точность метода определения процентного содержания генетически модифицированных ингредиентов в пище с помощью метода ПЦР «в реальном времени»

Предметный указатель

скачать (читать) книгу: «ПЦР в реальном времени»