Діагностики на основі методу ПЛР

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) — це сучасний молекулярно-генетичний метод, що дає змогу виявляти навіть мінімальні кількості нуклеїнових кислот (ДНК або РНК) у біологічному матеріалі. З моменту свого винаходу 1983 року американським біохіміком Кері Муллісом, ПЛР зробила революцію в діагностиці інфекційних захворювань, генетичних мутацій і навіть у судовій медицині. Цей метод вирізняється високою чутливістю, точністю і швидкістю, що робить його незамінним інструментом у лабораторній діагностиці XXI століття.

Принцип дії ПЛР

Фахівці Біокор Текнолоджі https://biocor-tech.com/ розповіли нам, що, суть методу полягає в багаторазовому копіюванні специфічної ділянки ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази. Процес проводиться в кілька етапів. Спочатку відбувається денатурація — поділ двох ланцюжків ДНК під дією високої температури. Потім настає етап відпалу праймерів — коротких послідовностей, які розпізнають цільову ділянку ДНК. Після цього запускається синтез нового ланцюга, де фермент відтворює копії фрагмента, що цікавить. Цикл повторюється десятки разів, у результаті чого можна отримати мільйони копій потрібного фрагмента всього за кілька годин.

Переваги ПЛР у діагностиці

Основна перевага ПЛР — це надзвичайно висока чутливість. Метод здатний виявити навіть поодинокі копії патогена у зразку, що особливо важливо під час ранньої діагностики вірусних інфекцій, таких як ВІЛ, гепатити або COVID-19. Ще однією важливою перевагою є висока специфічність. Праймери розробляються таким чином, щоб вони зв'язувалися тільки з певною послідовністю, що виключає хибнопозитивні результати. Також метод вирізняється швидкістю: результати можуть бути отримані протягом кількох годин після забору матеріалу.

Галузі застосування ПЛР-діагностики

ПЛР широко застосовують у найрізноманітніших галузях медицини та біології. В інфекційній діагностиці метод використовують для визначення вірусів, бактерій, грибків і паразитів. Особливо він актуальний у випадках, коли традиційні методи посіву виявляються неефективними через повільне зростання мікроорганізмів або їхню нестабільну життєздатність. Крім того, ПЛР активно застосовується в онкології для виявлення мутацій, пов'язаних із раком, і в генетиці - для діагностики спадкових захворювань. В акушерстві та гінекології ПЛР використовується для скринінгу TORCH-інфекцій у вагітних. У судовій медицині цей метод допомагає ідентифікувати особи за мікроскопічними слідами ДНК. Також ПЛР використовують у ветеринарії, харчовій промисловості та біотехнологічних дослідженнях.

Різновиди ПЛР

Сучасна ПЛР-технологія включає в себе кілька модифікацій. Класична ПЛР дає змогу просто визначити наявність або відсутність фрагмента ДНК. Реал-тайм ПЛР (або кількісна ПЛР) дає змогу не лише визначити факт наявності, а й виміряти кількість генетичного матеріалу в зразку, що важливо, наприклад, для моніторингу вірусного навантаження в пацієнтів із ВІЛ або гепатитом. Також існує мультиплексна ПЛР, за якої одночасно визначається кілька патогенів в одному зразку. Є й зворотна транскриптазна ПЛР (RT-ПЛР), що використовується для діагностики РНК-вірусів, таких як вірус грипу або коронавірус SARS-CoV-2.

Якісні тест-системи ПЛР:

• Vector-Best — системи для виявлення патогенів, генетичних мутацій та онкомаркерів.
• Біокор Текнолоджі — якісні ПЛР-набори українського виробника для діагностики широкого спектра захворювань.
• Roche (LightCycler) — швейцарські системи, які активно застосовуються в клініках по всьому світу.
• Bio-Rad — американські ПЛР-набори, включно з qPCR і RT-PCR рішеннями.
• Qiagen — німецькі тест-системи, зокрема для РНК-вірусів і онкологічних маркерів.
• Thermo Fisher Scientific — широкий асортимент тестів для лабораторної діагностики, включно з TaqMan-наборами.
• Cepheid (GeneXpert) — автоматизовані ПЛР-платформи для експрес-діагностики в режимі «біля ліжка хворого».

Підготовка та проведення аналізу

Для ПЛР підходить широкий спектр біологічних матеріалів — кров, мазки з носоглотки, слина, сеча, сперма, тканини і навіть навколоплідні води. Дуже важливо дотримуватися стерильності та правил транспортування, щоб не допустити забруднення і деградації нуклеїнових кислот. На лабораторному етапі спочатку проводиться екстракція ДНК або РНК, потім виконується ампліфікація, і, нарешті, проводиться інтерпретація результатів. Залежно від використовуваного обладнання результати можуть бути представлені як у вигляді графіків (у кількісній ПЛР), так і у вигляді стандартного висновку про наявність або відсутність генетичного матеріалу.

Обмеження і ризики методу

Незважаючи на всі переваги, у ПЛР є і деякі обмеження. Наприклад, метод не розрізняє живі та мертві мікроорганізми, що може давати позитивний результат навіть після успішного лікування. Також існує ризик хибнопозитивних результатів через контамінацію зразків. Вартість аналізу та обладнання також може бути високою, особливо при масовому тестуванні. Проте з розвитком технологій ці проблеми поступово знижуються.

Перспективи розвитку ПЛР-діагностики

З кожним роком ПЛР-технології стають дедалі доступнішими та зручнішими. З'являються портативні пристрої, які дають змогу проводити діагностику на місці — у клініках, на кордоні, вдома. Розробляються чіпи і картриджі, які автоматизують весь процес від екстракції до видачі результату. Збільшується точність і швидкість тестів, знижується ціна. У майбутньому ПЛР стане основою персоналізованої медицини, коли за генетичним аналізом можна буде підбирати лікування, профілактику і навіть прогнозувати захворювання задовго до появи симптомів.