Холера Эль-Тор на современном этапе седьмой пандемии: эволюция возбудителя, клинико-эпидемиологические особенности, лабораторная диагностика

И.В. Савельева, А.Н. Куличенко, В.Н. Савельев, Д.А. Ковалев, Т.В. Таран, Е.И. Подопригора, О.В. Васильева, Н.А. Шапаков

Седьмая пандемия холеры, начавшаяся на о. Сулавеси (Индонезия) в 1961 г., в настоящее время характеризуется интенсивными проявлениями инфекции в Африке, Азии и в Карибском бассейне на Гаити с высокой вероятностью выноса инфекции вследствие возрастающей активности миграции населения в другие страны, в том числе и в Россию. Основным возбудителем седьмой пандемии на протяжении более тридцати лет являлся холерный вибрион O1 биотипа Эль-Тор, геном которого содержит гены оперона ctxAB, кодирующие синтез термолабильного экзотоксина (СТ-2) — главного патогенетического фактора холеры. Типичные токсигенные вибрионы Эль-Тор (V. cholerae O1 biotype El Tor, Hly—, ctxA+), устойчивые к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды за счет присутствия в их геноме островков персистенции (EPI), патогенности (VPI-1 и VPI-2) и пандемичности (VSP-I и VSP-II), были этиологическим фактором холеры в Азии (1961—1969 гг.), в Азии, Африке, Европе, США, Океании (1970—1980 гг.), в Азии, Африке, Европе, США, Океании, Австралии (1981—1990 гг.) [11, 12, 15].

В начале 90-х гг. прошлого столетия вследствие эволюционных преобразований появились штаммы холерного вибриона биовара Эль-Тор с генотипическими признаками классического биовара, продуцирующие классический тип энтеротоксина (СТ-1), обозначенные как гибридные, или генетически измененные холерные вибрионы биовара Эль-Тор; они стали доминантными этиологическими агентами на современном этапе развития седьмой пандемии холеры Эль-Тор, а в первые два десятилетия XXI в., обладая высоким эпидемическим потенциалом, распространились по всему миру [2, 7, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 18, 19].

В России завозные случаи холеры, обусловленные геновариантами биовара Эль-Тор, регистрировались в 1993 г. — завоз холеры в Дагестан из Пакистана; в 1994 г. — завоз в Дагестан паломниками, совершавшими хадж в Мекку; в 1998 г. — в Дагестан из Азербайджана; в 1999 г. — в Приморский край и на Сахалин из Китая; в 2010, 2012, 2014 гг. — авиарейсами из Индии в Москву. Этиологический фактор завозной холеры был в то время идентифицирован как типичный токсигенный холерный вибрион биовара Эль-Тор.

Цель данного исследования — изучение и анализ биологических, молекулярно-генетических свойств геновариантов холерного вибриона биовара Эль-Тор и клинико-эпидемиологических особенностей обусловленной ими холеры на Кавказе; совершенствование лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за современной холерой Эль-Тор.

Материалы и методы

В работе использованы 246 штаммов типичных токсигенных V. cholerae O1 биотипа Эль-Тор, выделенные в период с 1970 по 1990 гг. от больных холерой и из объектов окружающей среды на территории Кавказа (в Азербайджане, Армении, Грузии, Дагестане, Краснодарском и Ставропольском краях), 7 штаммов V. cholerae cholerae, выделенные в Индии, Пакистане в 1949, 1950 и 1965 гг. и 133 штамма генетически измененных холерных вибрионов биовара Эль-Тор, изолированных от больных в Дагестане в 1993, 1994 и 1998 гг. Все штаммы микроорганизмов получены из лаборатории «Коллекция культур патогенных микроорганизмов» ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. Выделение, культивирование и идентификацию холерного вибриона осуществляли в соответствие с МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры» [4]. Анализ структуры генома изучаемых штаммов холерных вибрионов осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе с помощью ПЦР-тест системы «Гены Vibrio cholerae О1, вариант ctxB— rstR— rstC, РЭФ» (ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора). Подготовку проб для полимеразной цепной реакции проводили согласно МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры» [4] и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности» [6]. Экстракция тотальной ДНК исследуемых штаммов микроорганизмов проводилась с использованием коммерческого набора для выделения нуклеиновых кислот «АмплиПрайм ДНК-сорб-АМ» (АмплиСенс, Россия).

Секвенирование геномной ДНК проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosistems) c набором реактивов BigDye Terminator v3.1 в соответствии с рекомендациями производителя. Исходные данные анализировали в программе Sequencing Analysis v5.4. При сопоставлении последовательностей были использованы программы FinchTV 1.4.0. b BLAST (NCBI). В качестве прототипных использовали нуклеотидные последовательности референс-штаммов V. cholerae N 16961 биовара Эль-Тор и классического биовара 0395, депонированных в базе данных GenBank.

Эпидемиологический анализ случаев заболеваний и вибриононосительства на Кавказе проводили в соответствии с руководствами «Эпидемиологический анализ» [3] и «Современный эпидемиологический анализ» [8]. С целью изучения эпидемиологических и клинических особенностей холеры, вызванной типичным токсигенным холерным вибрионом Эль-Тор, проведен ретроспективный анализ 198 эпидкарт и 410 историй болезни больных холерой (Дагестан, 1970—1973 гг., Ставрополь, 1990 г.), обусловленной типичным токсигенным холерным вибрионом биовара Эль-Тор, и 237 историй болезни больных и вибриононосителей из очагов холеры, этиологическим фактором которой явился генетически измененный (гибридный) вариант холерного вибриона биовара Эль-Тор в Республике Дагестан (Каякентский, Бабаюртовский, Кизлярский районы, гг. Избербаш, Дербент в 1993, 1994, 1998 гг.).

Результаты и обсуждение

Морфологические и фенотипические свойства возбудителя современной холеры Эль-Тор

Установлено, что, независимо от места и времени изоляции штаммов изучаемых микроорганизмов, последние таксономически относятся к роду Vibrio семейства Vibrionaceae, виду Vibrio cholerae серологической группы Оl, серовару Ogawа или Inaba.

Вместе с тем оказалось, что если типичные токсигенные холерные вибрионы Оl серологической группы (выделенные в 1970—1990 гг.) фенотипически были биоваром Эль-Тор (устойчивы к 50 ЕД полимиксина В, агглютинировали эритроциты морской свинки, образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогеса—Проскауэра, лизировались диагностическим бактериофагом Эль-Тор II), то часть (48,7%) генетически измененных вариантов имели смешанные фенотипические свойства биовара Эль-Тор и классического, что не позволяет отнести изучаемые штаммы холерных вибрионов к определенному биовару по набору традиционных фенотипических тестов. Учитывая выявленную изменчивость фенотипических признаков, определяющих классический биовар или биовар Эль-Тор, возникает необходимость поиска более стабильных генетических меток, свойственных тому или иному биовару. Поэтому в существующую схему биотипирования мы включили маркерные гены классического биовара (ctxB^C+, rtxC—), биовара Эль-Тор (ctxB^El+), геноварианта биовара Эль-Тор (ctxB^Cl+, rtxC+).

С целью совершенствования биотипирования Vibrio cholerae Оl в связи с глобальным распространением генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль-Тор нами разработана схема биогенотипирования данных микроорганизмов (табл. 1).

Таблица 1

Схема биогенотипирования Vibrio cholerae О1 / A scheme of Vibrio cholerae O1 bio-genotyping

Примечание. Данные, представленные в табл. 1, позволяют подразделять V. cholerae O1, с учетом значения традиционных фенотипических тестов и маркерных генов, на биовары: классический, Эль-Тор и генетически измененный (гибридный) биовар Эль-Тор с определением его генотипов. Note. The data presented allow to assign V. cholerae O1 to various biovars based on using data on routine phenotypic tests and gene markers: classical, El Tor and genetically modified (hybrid) El Tor biovar with its genotypes defined.

Молекулярно-генетическая структура генома геновариантов биовара Эль-Тор

Молекулярно-генетический анализ измененных вариантов биовара Эль-Тор, выделенных в Дагестане (1993, 1994, 1998 гг.), показал, что эволюционные преобразования типичного токсигенного биовара Эль-Тор (Кавказ, 1970— 1990 гг.) в геновариант сопровождались изменениями структуры генов токсигенности коровой области профага СТХ_ф и профага RS1^ Так, изучаемые гибридные варианты биовара Эль-Тор в своем геноме содержат, помимо эльторовских, гены классического биовара (ctxB^Cl и/или rstR^Cl), a также, как и типичные токсигенные холерные вибрионы Эль-Тор, острова персистенции (EPI), патогенности (VPI-1,2) и пандемичности (VSP-1,2), но только у геновариантов биовара Эль-Тор обнаруживается интегративный и ко-ньюгативный элемент SXT с генами полирезистентности к антибиотикам (табл. 2).

Таблица 2

Структура генома типичных и измененных холерных вибрионов биовара Эль-Тор, выделенных от больных на Кавказе, по результатам ПЦР-анализа / PCR-based genome structure for typical and altered El Tor biovar cholera vibrio isolated from patients in the Caucasus Region

Особенности патогенеза и клиники холеры, обусловленной геновариантами холерного вибриона биовара Эль-Тор

Процесс инфекционного заболевания, в том числе и холеры, обусловлен специфическими свойствами возбудителя, которые напрямую связаны с эволюционными изменениями молекулярно-генетической организации типичных холерных вибрионов биовара Эль-Тор: замена аллеля В3 в опероне ctxAB на аллель В1 привела к большей и качественно иной продукции основного патогенетического фактора болезни — холерного энтеротоксина (СТ-1 вместо СТ-2). Вследствие этого эпидемические вспышки холеры, обусловленные геновариантами биовара Эль-Тор, имевшие место в Дагестане (1993— 1998), во Владивостоке (1999 г.), на Украине (1994, 2011 гг.), характеризовались преобладанием тяжелых форм течения болезни с выраженным обезвоживанием (III—IV степень), которые отмечены соответственно у 49,15, 65,2 и 68,8% больных, то есть холера, обусловленная генова-риантами холерного вибриона биовара Эль-Тор, по своему течению соответствует классической (азиатской) холере. Патогенетические особенности типичного (действие на энтероциты тонкой кишки холерного токсина второго типа) и гибридного варианта холерного вибриона Эль-Тор (действие на энтероциты тонкой кишки холерного токсина первого типа) определили характер и выраженность клинических проявлений инфекционного процесса (табл. 3).

Таблица 3

Количество случаев и тяжесть течения холеры, вызванной типичными (1) и гибридными вариантами (2) холерного вибриона Эль-Тор / Incidence rate and severity of cholera course caused by typical (1) and hybrid (2) El Tor cholera vibrio variants

Источником холеры, обусловленной типичными холерными вибрионами биовара Эль-Тор или его геновариантами, является человек. Механизм заражения един — фекально-оральный. Однако основной путь реализации этого механизма для типичного холерного вибриона Эль-Тор — водный (97% в г. Ставрополе в 1990 г. и 80% в Дагестане в 1970—1981 гг.), а для гено-варианта Эль-Тор — контактно-бытовой (58,3% в Дагестане в 1994 г.). Первичные заражения при употреблении для питья и хозяйственнобытовых нужд воды поверхностных водоемов, зараженных типичными вибрионами Эль-Тор, реализуются за пределами семейного очага. При холере, вызванной гибридными вариантами Эль-Тор, осуществляется занос инфекции в семью с последующим распространением среди ее членов при реализации бытовых факторов передачи в условиях низкого санитарного уровня проживающих: в очагах инфекции гибридный вариант Эль-Тор обнаруживается в смывах с кухонного стола, умывальника, унитаза, ручек дверей туалета, что способствует формированию значительного процента очагов с двумя и более случаями заболеваний (табл. 4). Изучая зависимость характера эпидемического процесса от биологических свойств различных вариантов токсигенных вибрионов Эль-Тор (табл. 4), мы пришли к выводу, что эпидемический тип проявления холеры Эль-Тор обусловливается как типичным V. cholerae O1 биотипа Эль-Тор (Hly^-, ctx+), так и гибридными вариантами холерного вибриона Эль-Тор. При этом показатели заболеваемости и инфицированности при холере, вызванной типичными токсигенными холерными вибрионами Эль-Тор, колебались соответственно от 0,5 до 19,6 на 100 тыс. населения (Ставропольский край, 1970—1975, 1990 гг.) 2,5 (Дагестан, 1970-1981) и от 0,5 до 28, 12,8 на 100 тыс. населения, а обусловленные гибридными вариантами холерного вибриона Эль-Тор — соответственно 55,8 и 117,6 (Дагестан, 1994) на 100 тыс. населения. В некоторых районах Дагестана в 1994 г. показатели инфициро-ванности населения гибридными вариантами Эль-Тор были еще выше: 568,1 на 100 тыс. населения (г. Избербаш) и 697,5 на 100 тыс. населения (Каякентский район) [5].

Таблица 4

Характеристика некоторых показателей эпидемического процесса холеры, обусловленной типичными (1) и гибридными (2) вариантами холерного вибриона O1 Эль-Тор / Characterization of some indicators of cholera epidemic process caused by typical (1) and hybrid (2) V. cholerae O1 El Tor variants

Примечание. К-б — контактно-бытовой путь.

Note. hc — household contact.

Механизм заражения типичным или гибридным вариантом холерного вибриона Эль-Тор один — фекально-оральный. Однако основной путь реализации этого механизма для типичного холерного вибриона Эль-Тор — водный (97,0% в г. Ставрополе в 1990 г. и 80,0% в Дагестане в 1970-1981 гг.), а для гибридного варианта Эль-Тор — контактно-бытовой (58,3% в Дагестане в 1994 г.). Контактно-бытовой путь передачи возбудителя болезни был доминирующим в горных районах Дагестана в 1994 г., его удельный вес достигал 64,6-96,4% (Шалинский, Тляратинский районы) [5]. При этом процент очагов с двумя и более случаями холеры, обусловленной типичными холерными вибрионами Эль-Тор, составил 22,0% (г. Ставрополь, 1990 г.). Первичные заражения здесь имели место непосредственно в семьях, все члены которых находились в одинаковых условиях водопользования родниковой водой, зараженной типичными холерными вибрионами Эль-Тор. Этот показатель оказался значительно более низким (12,0%) в Дагестане в 1970-1981 гг., когда первичные заражения реализовывались за пределами семейного очага при употреблении для питья и хозяйственно-бытовых нужд воды поверхностных водоемов, зараженных типичными вибрионами Эль-Тор.

Семейные очаги вообще не были зарегистрированы при спорадической заболеваемости холерой, вызванной типичными вибрионами Эль-Тор.

В период эпидемии холеры в 1994 г. в Дагестане, вызванной гибридными вариантами Эль-Тор, осуществлялся занос холеры в семью с последующим распространением среди ее членов при реализации бытовых факторов передачи. Анализ 84 очагов холеры в Дербенте и 38 очагов в сельской местности Дербентского и Каякентского районов показал, что процент очагов с двумя и более случаями инфицирован-ности (больные и вибриононосители) оказался довольно высоким и составил в Дербенте 37,6%, а в сельской местности — 43,3%. Имели место и очаги с 4-7 случаями [1].

В целом по республике очаговость составила на трех административных территориях 25,1%, на четырех — 41,8%, на двадцати четырех 50,2— 94,7% [1].

Инфицированность в семьях типичным холерным вибрионом Эль-Тор составила 22,0% в Ставрополе в 1990 г. и 10—12,0% в Дагестане в 1970—1981 гг., а гибридным вариантом холерного вибриона Эль-Тор в Дагестане в 1994 г. — 40,3%. В отличие от холеры, обусловленной типичными холерными вибрионами Эль-Тор, контактных и больных холерой, вызванной геновариантами биовара Эль Тор, выявляли в Дагестане в 1994 г. по месту работы (27,2%), учебы (1,36%), в холерных госпиталях (4,4%), в режимном учреждении (0,99%).

Первые выявленные случаи холеры, вызванной типичными или гибридными вариантами холерного вибриона Эль-Тор, были завозными и манифестными.

Лабораторная диагностика современной холеры Эль-Тор

Эволюционные преобразования генома возбудителя холеры, начавшиеся в девяностые годы прошлого столетия, продолжаются, в связи с чем программа эпидемиологического надзора должна включать постоянный молекулярно-генетический мониторинг за изменениями генома холерных вибрионов, обнаруживаемых у человека или в объектах окружающей среды. С этой целью ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора разработана и рекомендована к применению на учрежденческом уровне ПЦР-тест-система «Гены Vibrio cholerae О1 вариант ctxB— rstR— rstC, РЭФ», позволяющая идентифицировать штаммы Vibrio cholerae О1 с определением биовара и дифференцировать биовар Эль-Тор на типичные токсигенные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов.

Выводы

1. Штаммы V. cholerae O1, выделенные в 1993, 1994, 1998 гг. в Дагестане, по основным фенотипическим свойствам не отличаются от типичного токсигенного холерного вибриона биовара Эль-Тор. Вместе с тем 48,7% изученных штаммов геновариантов холерного вибриона имели смешанные фенотипические свойства Эль Тор и классического биоваров, что диктует необходимость в существующую схему биоти-пирования включить маркерные гены классического биовара (ctxB^C+, rtxC—), биовара Эль-Тор (ctxBEl+), геновариантов биовара Эль-Тор (ctxB^Cl+, rtxC+), выявляемые в ДНК холерных вибрионов методом ПЦР.
2. Молекулярно-генетический анализ штаммов биовара Эль-Тор, выделенных в Дагестане (1993, 1994, 1998 гг.), показал, что структура их генома претерпела эволюционные преобразования в коровой области профага СТХ_ф и профага RS^: изучаемые штаммы биовара Эль-Тор в своем геноме содержат, помимо эльторовских, гены классического биовара (ctxB^Cl и/или rstR^Cl). Такие штаммы получили название «гибридные», или «генетически измененные», варианты холерного вибриона биовара Эль-Тор. Как и типичные токсигенные холерные вибрионы Эль-Тор, они имеют острова персистенции (EPI), патогенности (VPI-1,2) и пандемично-сти (VSP-I,II), но только у геновариантов биовара Эль-Тор обнаруживается интегративный и конъюгативный элемент SXT с генами полирезистентности к антибиотикам.
3. Особенности процесса инфекционного заболевания, в том числе и холеры, обусловлены специфическими свойствами возбудителя, которые напрямую связаны с эволюционными изменениями молекулярно-генетической организации типичных холерных вибрионов биовара Эль-Тор: замена аллеля В3 в опероне ctxAB (штаммы холерного вибриона, выделенные на Кавказе с 1970 по 1990 гг.) на аллель В1 (штаммы геновариантов холерного вибриона, выделенные на Кавказе в 1993, 1994, 1998 гг.) привела к большей и качественно иной продукции основного патогенетического фактора болезни — холерного энтеротоксина (СТ-1 вместо СТ-2). Вследствие этого эпидемические вспышки холеры, обусловленные геновариантами биовара Эль-Тор, по своему течению соответствуют вспышкам классической (азиатской) холеры.
4. Выявлены эпидемиологические особенности современной холеры. Источником холеры, обусловленной типичными холерными вибрионами биовара Эль-Тор или его геновариантами является человек. Механизм заражения един — фекально-оральный. Однако основной путь реализации этого механизма для типичного холерного вибриона Эль-Тор (штаммы холерного вибриона, выделенные на Кавказе с 1970 по 1990 гг.) — водный, а для геноварианта Эль-Тор (штаммы геновариантов холерного вибриона, выделенные на Кавказе в 1993, 1994, 1998 гг.) — контактно-бытовой. Первичные заражения при употреблении для питья и хозяйственно-бытовых нужд воды поверхностных водоемов, зараженных типичными вибрионами Эль-Тор, реализуются за пределами семейного очага. При холере, вызванной гибридными вариантами Эль-Тор, осуществляется занос инфекции в семью с последующим распространением среди ее членов при реализации бытовых факторов передачи в условиях низкого санитарного уровня проживающих.
5. В основе совершенствования лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора за современной холерой Эль-Тор лежит использование ПЦР-тест-систем с учетом эволюционных преобразований генома типичного токсигенного холерного вибриона в геновари-ант биовара Эль-Тор. Эволюционные преобразования генома возбудителя холеры, начавшиеся в девяностые годы прошлого столетия, продолжаются, возможно формирование других генетически измененных вариантов холерного вибриона биовара Эль-Тор, но эпидемический потенциал их будет определяться продукцией энтеротоксина первого типа. В связи с этим программа эпидемиологического надзора должна включать постоянный молекулярно-генетический мониторинг за изменениями генома холерных вибрионов различных серологических групп, обнаруживаемых у человека или в объектах окружающей среды, что позволит своевременно прогнозировать появление генетически измененных вариантов с продукцией холерного токсина классического типа.

Список литературы/References

1. Грижебовский Г.М., Асваров Б.М., Попов В.А., Евченко Ю.М., Савельев В.Н., Ефременко В.И., Ляховер М.Л., Рахоев М.-Р.А., Кадиев Ш.З., Сеидова М.М., Таран О.И. О механизмах внутриочагового и территориального распространения холеры в Республике Дагестан // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, приложение. 1995. № 2. С. 27—30. [Grizhebovskiy G.M., Asvarov B.M., Popov V.A., Evchenko Yu.M., Savel’ev V.N., Efremenko V.I., Lyakhover M.L., Rakhoev M.-R.A., Kadiev Sh.Z., Seidova M.M., Taran O.I. About the mechanisms of intrafo-cal and territorial spreading of cholera in Dagestan Republic. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii, prilozhenie = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology (Suppl.), 1995, no. 2, pp. 27—30. (In Russ.)]
2. Заднова С.П., Шашкова А.В., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Фенотипический и генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль-Тор // Проблемы особо опасных инфекций. 2012. № 1 (111). С. 57—61. [Zadnova S.P., Shashkova A.V., Krasnov Ya.M., Smirnova N.I Phenotypic and Genetic Analysis of Altered Variants of Vibrio cholerae Biovar El Tor. Problemy osobo opasnykh infektsiy = Problems of Particularly Dangerous Infections, Saratov, 2012, no. 1 (111), pp. 57-61 (In Russ.)] doi: 10.21055/0370-1069-2012-1(111)-57-61
3. Клименко Е.П., Попов В.Ф., Степанов Г.П. Эпидемиологический анализ. М.: Медицина, 1983. 192 с. [Klimenko E.P., Popov V.F., Stepanov G.P. Epidemiological analysis. M.: Medicine, 1983. 192 p. (In Russ.)]
4. Лабораторная диагностика холеры. Методические указания. МУК 4.2.2218-07. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. 87 с. [Cholera laboratory diagnostics. Methodical guidelines. MG 4.2.2218-07. M.: Federal Centre of Hygiene and и Epidemiology of Rospotrebnadzor, 2007. 87p. (In Russ.)]
5. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Чебураев В.И., Ляховер М.Л., Рахоев М.-Р.А., Терентьев А.Н., Асва-ров Б.М., Чернышов С.Н., Гаджиева С.З., Исмаилов Ф.М., Бугаков Н.П. Холера в начале века. Прогноз // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, приложение. 2005, № 3. С. 44—48. [Onishchenko G.G., Lomov Yu.M., Moskvitina E.A., Cheburaev V.I., Lyakhover M.L., Rakhoev M.-R.A., Terent’ev A.N., Asvarov B.M., Chernyshov S.N., Gadzhieva S.Z., Ismailov F.M., Bugakov N.P. Cholera at the beginning of the XXI century. Prognosis. Zhurnal mikrobiologii, epide-miologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2005, no. 3, pp. 43-48 (In Russ.)]
6. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности: методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. 51 с. [Arrangement of work of laboratories using Nucleic Acid Amplification Techniques on materials containing microorganisms of I—IV pathogenic risk groups: methodical guidelines. М.: Federal Centre of Hygiene and и Epidemiology of Rospotrebnadzor, 2010. 51 p. (In Russ.)]
7. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.П., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio choleraе биовара Эль-Тор, изолированных на территории России в современный период // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011, № 3. С. 11—17. [Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.P., Kutyrev V.V. Genome variability in the altered variants of Vibrio cholerae biovar El Tor isolated in Russia. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i vi-rusologiya = Molecular Genetics, Microbiology and Virology, 2011, no. 3, pp. 11-17. (In Russ.)]
8. Шаханина И.Л., Чернова Г.П., Ивлиева И.М. Современный эпидемиологический анализ: обзорная информация. М.: ВНИИМИ, 1987. 71 с. [Shakhanina I.L., Chernova G.P., Ivlieva I.M. Modern epidemiological analysis: survey information. M.: VNIIMI, 1987. 71 p. (In Russ.)]
9. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T., Chatterjee S., Asacura M., Yamasaki S., Nair G.B., Takeda Y. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio chole-rae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol., 2010, vol. 48, no. 11, pp. 4283-4286. doi: 10.1128/ JCM.00799-10
10. Grim C.J., Hasan N.A., Taviani E. Hybrid Vibrio cholerae O1 MJ-1236, B-33, and CIRS 101 and cjmharative genomics with V. cholerae. J. Bacteriol., 2010, vol. 45, pp. 2991- 3000. doi: 10.1128/JB.00040-10
11. Haan J., Hirst N.R. Cholera toxin: a paradigme for multi-functional engagement of cellular mechanisms. Mol. Membr. Biol., 2004, vol. 21, no. 2, pp. 77-92. doi: 10.1080/09687680410001663267
12. Dziejman M., Balon E., Boyd D., Fraser C.M., Heidelberg J.F., Mekalanos J.J. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and handemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, vol. 99, no. 3, pp. 1556-1561. doi: 10.1073/pnas.042667999
13. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J. Cholerae due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol., 2006, vol. 44, pp. 4211-4213. doi: 10.1128/JCM.01304-06
14. Nguyen B.M., Lee J.H., Cuong N.T. Gholerae outbreaks caused by an altered Vibrio cholera O1 El Tor strain producing classical cholera toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. J. Clin. Microbiol., 2009, vol. 47, no. 5, pp. 1568-1571. doi: 10.1128/JCM.02040-08
15. Pradhan S., Baidya A.K., Ghosh A., Paul K., Chowthury R. The El Tor biotype of Vibrio cholerae exhibits Vibrio cholerae a growth advantage in the stationary phase in mixt cultures with the classical biotype. J. Bacteriol., 2010, vol. 192, no. 4, pp. 955963. doi: 10.1128/JB.01180-09
16. Raychoudhuri A., Patra T., Ramamurthy T., Nandy R., Takeda Y., Nair G.B., Mukhopadhyay A.K. Classical ctxB in Vibrio cho-lerae O1, Kalkata, India. Emerg. Infect. Dis., 2009, vol. 15, no. 1, pp. 131-132. doi: 10.3201/eid1501.080543
17. Safa A., Sultana J., Cam P.D., Mwansa J.C., Kong R.Y.C. Vibrio cholerae O1 hybrid El Tor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis., 2008, vol. 15, no. 6, pp. 987-988. doi: 10.3201/eid1406.080129
18. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol., 2010, vol. 18, pp. 46-54. doi: 10.1016/j.tim.2009.10.003
19. Siddique A.K., Nair G.B., Alam M., Sack D.A., Hug A., Nizam A., Longini I.M., Qadri M., Faruque S.M., Colwell R.R., Ahmed S., Igbal A., Bhuiyan N.A., Sack R.B. El Tor cholera with severe disease: a new threat to Asia and Benond. Epidemiol. Infect., 2010., vol. 138, no. 3, pp. 346-352. doi: 10.1017/S0950268809990550